• 【發(fā)布單位】國家食品藥品監(jiān)督管理局
• 【發(fā)布文號】國食藥監(jiān)注[2005]493號
• 【發(fā)布日期】2005-10-14
• 【生效日期】2005-10-14
• 【失效日期】--
• 【文件來源】國家食品藥品監(jiān)督管理局
• 【所屬類別】政策參考

多肽疫苗生產(chǎn)及質(zhì)控技術(shù)指導(dǎo)原則

多肽疫苗生產(chǎn)及質(zhì)控技術(shù)指導(dǎo)原則

(國食藥監(jiān)注[2005]493號)





各省,、自治區(qū),、直轄市食品藥品監(jiān)督管理局（藥品監(jiān)督管理局）：



 為規(guī)范疫苗研發(fā)行為，指導(dǎo)疫苗研究單位科學(xué)地開展研究工作,，根據(jù)《藥品管理法》,、《藥品管理法實施條例》及《藥品注冊管理辦法》，我局組織制定了《預(yù)防用疫苗臨床前研究技術(shù)指導(dǎo)原則》,、《生物制品生產(chǎn)工藝過程變更管理技術(shù)指導(dǎo)原則》,、《聯(lián)合疫苗臨床前和臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》、《多肽疫苗生產(chǎn)及質(zhì)控技術(shù)指導(dǎo)原則》,、《結(jié)合疫苗質(zhì)量控制和臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》和《預(yù)防用疫苗臨床試驗不良反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)原則》等6個技術(shù)指導(dǎo)原則,，現(xiàn)印發(fā)給你們，并請轉(zhuǎn)發(fā)轄區(qū)內(nèi)各有關(guān)單位,。



國家食品藥品監(jiān)督管理局

二○○五年十月十四日





多肽疫苗生產(chǎn)及質(zhì)控技術(shù)指導(dǎo)原則



 前 言



 多肽疫苗是按照病原體抗原基因中已知或預(yù)測的某段抗原表位的氨基酸序列,，通過化學(xué)合成技術(shù)制備的疫苗。傳統(tǒng)疫苗一般由兩種方式制備，一種為能誘發(fā)免疫力卻不致病的減毒疫苗,，例如黃熱病,、脊髓灰質(zhì)炎和麻疹疫苗或卡介苗；另一種為滅活疫苗（例如百日咳桿菌,、狂犬病毒,、傷寒桿菌）。多肽疫苗由于完全是合成的,，不存在毒力回升或滅活不全的問題,。特別是一些還不能通過體外培養(yǎng)方式獲得足夠量的抗原的微生物病原體。有些雖能進(jìn)行體外培養(yǎng),，但這些病原體有潛在致病性和免疫病理作用等涉及安全性與有效性的問題,。多肽作為體內(nèi)引起效應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答形成的免疫原，將成為一種新型的疫苗,，但還有很多理論和技術(shù)問題要繼續(xù)研究,，目前尚無多肽疫苗獲準(zhǔn)上市。因此,，應(yīng)采取適當(dāng)可行的途徑對這種潛能疫苗進(jìn)行生產(chǎn)及質(zhì)控,，并在其生產(chǎn)過程中積累經(jīng)驗，為此,，應(yīng)加強(qiáng)咨詢和論證,，以便提出一個確保安全有效而又適合實際的申報資料。同時,，對每個方案中各個階段的操作過程,、中間及最終產(chǎn)品的制備，務(wù)必制定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),，并予嚴(yán)格實施,。



 一、多肽疫苗的化學(xué)合成

 首先應(yīng)該確定天然抗原的氨基酸序列,，選擇和確定尋找有效肽段的方法,，并尋找該肽段所針對的抗原決定簇。



 其次應(yīng)選擇合適的合成方法,。合成中等大小的多肽也會涉及眾多反應(yīng),，每加入一個氨基酸需多次反應(yīng)，在一個氨基酸的α氨基與另一個氨基酸的羧基縮合形成肽鏈之前,，必須使其中一個形成高反應(yīng)的活化狀態(tài),，這個選擇自然落到羧基上，合成因而從C到N端,。如果A氨基酸的C端與B氨基酸的N端縮合產(chǎn)生2肽A－B,，則A的N端及B的C端必須保護(hù)起來,，才能轉(zhuǎn)化成在A－B之間形成特異性肽的形式。此外,，氨基肽的側(cè)鏈基團(tuán)也能與活化羧基反應(yīng),，因此也必須保護(hù)起來。這些側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)必須能耐受除去α－氨基保護(hù)基團(tuán)的條件,，這樣才能生成新的氨基基團(tuán)使肽鏈得以繼續(xù)延長,。合成結(jié)束后必須除去所有的保護(hù)性基團(tuán)以得到所需的多肽。多肽的合成循環(huán)包括了一系列的反應(yīng),，每一循環(huán)生成一個新肽鍵,。



 主要有兩個合成策略：片段濃縮法和固相合成法（merrifield法）。片段濃縮法是經(jīng)典的

合成技術(shù),。首先合成數(shù)條小肽,，經(jīng)純化和去保護(hù)后結(jié)合成較長的肽，直到最后所需的序列,。



 在固相合成法是將肽鏈一端結(jié)合于固相載體上的方法,。通過在N－末端逐步加上氨基酸的方法合成肽段。



 另外也引入一些新進(jìn)展包括改良的保護(hù)基因,、新的固相載體,、脫保護(hù)及側(cè)鏈功基保護(hù)等新方法。在疫苗合成領(lǐng)域中,，由于肽鏈聯(lián)接或裝配到需要的結(jié)構(gòu)（TADPs）及免疫原性構(gòu)架（MAPs）所用技術(shù)的引進(jìn),，加上肽鏈經(jīng)脂質(zhì)或碳水化合物的修飾作用，使得合成問題變得更加復(fù)雜,。目前多應(yīng)用固相法,，特別是在選擇和確定有效抗原表位研究方面，是合成多肽疫苗的一條可供選擇的途徑,。



 二,、多肽疫苗的生產(chǎn)工藝及質(zhì)控

 （一）應(yīng)提供研制某一疫苗的詳細(xì)資料,，包括選擇特定抗原決定簇的理由,、對抗原決定簇的檢定，以及對載體,、表位連接,、結(jié)合劑、肽的呈遞方式及佐劑等的選擇理由及其相應(yīng)證據(jù),。



 （二）應(yīng)說明每條肽段所針對的抗原表位,。內(nèi)容包括對每個表位來源的說明，當(dāng)不止一個表位時,，應(yīng)說明把不同表位相互結(jié)合到一個已知序列內(nèi)的理由,，此外還應(yīng)對表位的類型（B,、Th、Tc等）及特殊組合方式進(jìn)行說明,。



 （三）應(yīng)當(dāng)提供肽鏈合成的詳細(xì)資料,。內(nèi)容包括：原料的來源和特性、使用的方法學(xué),、氨基酸的連接和脫保護(hù),，進(jìn)入下一步連接的判斷標(biāo)準(zhǔn)，任何加入的修飾基團(tuán)（例如糖基化,，脂質(zhì)化）的詳細(xì)情況,。如果采用了液體合成法，應(yīng)當(dāng)提供包括對中間體有特殊說明的流程圖,。



 （四）如果肽單體為中間產(chǎn)物,，應(yīng)當(dāng)對其分離鑒定并提供下述確證依據(jù)。

 1．主要肽順序與預(yù)期的結(jié)構(gòu)相同,，例如,，目標(biāo)氨基酸按需要的順序排列；修飾（脂化及糖基化）情況,；

 2．對肽單體中的主要雜質(zhì)（可能情況下對次要雜質(zhì)）應(yīng)分離鑒定,。驗證純度時應(yīng)采用多種技術(shù)對其理化特性盡可能多地檢查，特別要注意檢測生產(chǎn)或純化過程中可能加入的物質(zhì),；

 3．連續(xù)多批產(chǎn)品的肽質(zhì)量應(yīng)保持一致,。



 （五）對肽單體或肽衍生物應(yīng)建立適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)。對肽的純度,、總雜質(zhì),、每種主要及次要雜質(zhì)都應(yīng)規(guī)定限度要求。



 （六）如果不能對肽單體進(jìn)行全面鑒定,，應(yīng)提供相應(yīng)說明,。



 （七）應(yīng)對肽的穩(wěn)定性進(jìn)行評價，并制定適當(dāng)?shù)馁A存期,。



 （八）偶聯(lián)物

偶聯(lián)物中多肽及其它成分除了達(dá)到適當(dāng)?shù)囊笸?，還應(yīng)符合下列規(guī)定：

 1．對偶聯(lián)物進(jìn)行驗證，其含量應(yīng)能重復(fù)并保持一致,，當(dāng)不止一種肽結(jié)合到同一載體上時,，應(yīng)對每一種肽所占比例進(jìn)行控制并能重復(fù)制備；

 2．最大限度降低副反應(yīng)并控制到能重復(fù)的水平,，這些副反應(yīng)包括載體之間的交聯(lián),，載體表面濃縮的未結(jié)合的偶聯(lián)劑，以及對未參與結(jié)合的偶聯(lián)劑的滅活等,；

 3．有證據(jù)表明偶聯(lián)物未改變抗原序列,；

 4．應(yīng)當(dāng)考慮機(jī)體對載體蛋白或其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的潛在臨床影響,；

 5．當(dāng)同一載體用于幾種疫苗或一種疫苗的幾種不同表位時，應(yīng)考慮特異性表位抑制的可能性,，并進(jìn)行調(diào)查,；

 6．應(yīng)當(dāng)最大限度地降低殘余溶劑或副產(chǎn)品的含量，并設(shè)定相應(yīng)限定要求,；

 7．應(yīng)當(dāng)設(shè)定適宜的可接受的標(biāo)準(zhǔn),，合適的參考制品可能是必要的。



 （九）載體

 肽可以聯(lián)接或結(jié)合到載體上,，選擇載體時應(yīng)謹(jǐn)慎,，因為對載體的免疫應(yīng)答可能會掩蔽對肽的免疫應(yīng)答。目標(biāo)人群中的一部分可能對某一載體存在過敏反應(yīng)或某些載體有刺激自身免疫的危險,，應(yīng)避免選擇這些載體,。載體應(yīng)有自已的檔案材料及相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，它包括：載體的鑒定,，生產(chǎn)一致性的證據(jù),，蛋白質(zhì)的安全性以及與蛋白質(zhì)、脂多糖,、多聚體,、脂質(zhì)體等相關(guān)的一些特征試驗。例如,，聚合體和脂多糖應(yīng)當(dāng)具有可重復(fù)的分子量范圍,，脂多糖具有一致的單糖組分，脂質(zhì)體具有一致的結(jié)構(gòu),、組分,。對不同成分及雜質(zhì)應(yīng)鑒別定性并加以定量測定，對于生物來源的載體應(yīng)當(dāng)采取措施,，確保檢測不出感染因子,。



 （十）聚合、烷化或載體合成肽

 無論是與聚合肽構(gòu)架（例如MAP）結(jié)合的肽,，或肽單體合成后再進(jìn)一步形成的聚合肽或烷化肽（例如,，通過未端半胱氨酸的氧化作用），也無論是單一肽鏈或與其它肽鏈的聚合,，都應(yīng)有相應(yīng)的證據(jù),，表明反應(yīng)過程達(dá)到了最后可重復(fù)的階段。



 （十一）佐劑,、防腐劑及其他添加成分為方便操作、增強(qiáng)穩(wěn)定性,、延長保存期以及修飾免疫原的類型和免疫原性,，原則上可在免疫原中選擇添加許多成分,。這些成分其特性變化較大，從小分子物質(zhì)到大分子菌體成分及合成聚合物等各不相同,，有作為非特異免疫增強(qiáng)劑的成分,，特異性免疫激活作用的成分及直接作用于不同免疫細(xì)胞的成分。其中許多會產(chǎn)生自身的毒性,，而且可能因與抗原聯(lián)合使用而顯著改變免疫反應(yīng),，從而引起安全性方面的其它顧慮。傳統(tǒng)佐劑是在礦物膠基礎(chǔ)上制成-氫氧化鋁,、磷酸鋁或磷酸鈣,，到目前為止批準(zhǔn)使用的佐劑鮮為他類。對已獲批準(zhǔn)的以鋁鹽及鈣鹽為基礎(chǔ)的佐劑,，其標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)達(dá)到藥用等級（不含重金屬離子,，質(zhì)量恒定，具有恒定的結(jié)合特征）,。由于滅菌可能會改變佐劑的結(jié)合特征,，對不同批次佐劑應(yīng)以可重復(fù)、持續(xù)的方式處理,。對于添加劑,，應(yīng)提供所有成分的明確說明，闡述使用的理由,。每種成分應(yīng)具有適當(dāng)?shù)姆治鰳?biāo)準(zhǔn)要求,，終配方中應(yīng)限定不同成分混合物的含量。此外,，應(yīng)全面評價配方的抗原及毒性特征,，特別注意不同成分的混合可能會導(dǎo)致抗原發(fā)生不良的修飾作用。

 如果在疫苗中加入防腐劑,，應(yīng)確定其含量,，該用量應(yīng)既不對疫苗中的各個成分產(chǎn)生不良作用，也不應(yīng)引起人體副反應(yīng),。單劑量制劑不應(yīng)添加防腐劑,。



 （十二）穩(wěn)定性

 進(jìn)行充分的穩(wěn)定性研究是研制疫苗的一項重要內(nèi)容。因此應(yīng)確定配方的穩(wěn)定性,，并以此建立合適貯存條件下的最大貨架期,。為確保每種成分的有效性，應(yīng)對到期產(chǎn)品的免疫原性及安全性進(jìn)行實時穩(wěn)定性研究,。



 三,、產(chǎn)品的質(zhì)量與檢定要求

 保證多肽制品的一致性極其重要，應(yīng)廣泛使用分析技術(shù),。應(yīng)對疫苗生產(chǎn)工藝的各個環(huán)節(jié)和步驟的各種成分（無論以單獨或偶聯(lián)方式）均應(yīng)建立相應(yīng)的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn),，包括原材料質(zhì)控,，加工過程的質(zhì)控和終產(chǎn)品的質(zhì)控，以保證終產(chǎn)品安全有效,。

 除應(yīng)符合常規(guī)的安全試驗（如無菌,、熱原試驗及異常毒性試驗），針對合成多肽的特點應(yīng)考慮：



 （一）純度：高效液相色譜（HPLC）,、毛細(xì)管電泳（CE）,、陽離子或陰離子色譜、等電聚焦,，依據(jù)分子大小的鑒別技術(shù)（分子篩層析,，還原、非還原SDS－PAGE 電泳）,，根據(jù)疏水性的鑒別技術(shù)（反相或疏水作用層析）等相應(yīng)分析的技術(shù),。



 （二）理化性質(zhì)均一性的確定：氨基酸序列分析（N/C末端）、肽圖,、MS以及氨基酸組成（AAA）分析,。



 （三）產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)



 （四）與生產(chǎn)過程相關(guān)的雜質(zhì)



 （五）人為修飾的檢測



 （六）效力試驗

 效力試驗并非一定反映出在人體內(nèi)的作用機(jī)制或功能活動。但是在合適情況下應(yīng)包括有關(guān)疫苗功能的適宜試驗,。效力試驗的主要目的是通過測定生物活性的方法,，確認(rèn)各批之間的一致性。因此應(yīng)考慮活體外及活體內(nèi)免疫性和抗原性測定試驗,。這種試驗應(yīng)將制品同時與參考品做比較,，而且試驗結(jié)果經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)檢驗。由于疫苗的作用模式會改變,，有關(guān)這類試驗的細(xì)節(jié)應(yīng)區(qū)別對待,，不能一概而論。但是應(yīng)確定試驗結(jié)果的可信限,，以便確定方法本身固有的變異,，為每批制品的平均值提供一個可信限幅度，并由此確定接受的標(biāo)準(zhǔn)及限值,，為此應(yīng)建立適宜的參考制劑,。



 （七）生物效價測定



 （八）建立內(nèi)部參考品：建立適當(dāng)?shù)膮⒖计穼崿F(xiàn)這些標(biāo)準(zhǔn)也是必要的。此外,，選取合適的一批中間產(chǎn)品及終產(chǎn)品（最好是選擇經(jīng)過臨床評價的制品）,，就其化學(xué)成分、純度及生物學(xué)活性進(jìn)行全面檢定,，而后保存下來作為化學(xué)或生物參考品,，可依此制定每批產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)要求。



 （九）佐劑、保護(hù)劑及其他添加成分：如果使用鋁或鈣的化合物作為佐劑,，其用量不應(yīng)超過常規(guī)用量范圍（每人用劑量的鋁佐劑含量應(yīng)不超過1.25mg,，鈣佐劑含量應(yīng)不超過1.3mg）,。對保護(hù)劑及其他添加劑應(yīng)確定相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),。



 四、臨床前安全評價

 臨床前安全評價的主要目的是確定新藥制品是否引起意外或不良的效應(yīng),。但推薦供化學(xué)藥使用的臨床安全及毒性試驗對于合成肽疫苗不甚相關(guān),。動物毒性試驗會產(chǎn)生種屬特異性方面的問題，因此,，多肽疫苗的安全評價應(yīng)考慮諸多因素,。有必要采取靈活的方法評價合成肽疫苗的臨床前安全性，應(yīng)當(dāng)充分考慮使用合成肽疫苗所產(chǎn)生不良免疫病理反應(yīng)的各種可能性,。



 必須確保使用的肽序列不具有明顯的不良藥理活性,。因此，應(yīng)篩查單體肽固有的毒性或藥理作用,。也應(yīng)考慮由聚合或偶合而產(chǎn)生的作用的可能性,。一種多肽可能有意想不到的次要活性，而這一活性可能會由于上述反應(yīng)而得到放大并產(chǎn)生危害,。因此,，應(yīng)全面檢查多肽及其偶合物的藥理活性。



 抗肽抗體可能與人體組織產(chǎn)生意想不到的交叉反應(yīng),，也可引發(fā)自身免疫反應(yīng),。因此，應(yīng)使用人體組織測定疫苗的最后配方及佐劑是否產(chǎn)生意外的交叉抗體,。偶合或聚合反應(yīng)能產(chǎn)生新的表位,，而僅僅評價肽單體不能解決該問題。毫無疑問安全試驗是必要的,，但選擇何種試驗則應(yīng)依靠實際情況而定,，并應(yīng)咨詢有關(guān)質(zhì)控當(dāng)局。對于臨床前安全性試驗,，應(yīng)廣泛使用生物學(xué),、生物化學(xué)、免疫學(xué),、毒理學(xué)及組織病理學(xué)等適當(dāng)?shù)难芯考夹g(shù),，在適當(dāng)?shù)那闆r下，可采用多個相關(guān)劑量并包括急性及慢性試驗,。