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中華人民共和國農業(yè)部公告第2078號

根據《獸藥管理條例》和《獸藥注冊辦法》規(guī)定,，我部組織制定了口蹄疫滅活疫苗內毒素和總蛋白測定法，現(xiàn)予發(fā)布,，自發(fā)布之日起執(zhí)行,。

特此公告。

附件：1.口蹄疫滅活疫苗內毒素測定法

2.口蹄疫滅活疫苗總蛋白測定法

農業(yè)部

2014年3月12日

附件1

口蹄疫滅活疫苗內毒素測定法

吸取12 ml疫苗放入15 ml離心管中,，置50±5℃水浴90分鐘,，然后在4℃條件下，以15000 g離心10分鐘，取水相5.0 ml,，按現(xiàn)行《中國獸藥典》一部附錄進行檢驗,。每頭份疫苗中內毒素含量應不高于50 EU。

附件2

口蹄疫滅活疫苗總蛋白測定法

取1瓶疫苗恢復至室溫,，在3個1.5ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮,，充分混勻，室溫放置10分鐘,，在4℃條件下,，以15000g離心15分鐘。吸棄液相,，沉淀物用400μl丙酮洗滌2次,，室溫干燥約15分鐘，加50μl去離子水復溶后,，按附注進行檢驗,。每毫升疫苗總蛋白含量應不高于500μg。

附注：口蹄疫滅活疫苗總蛋白測定法

1.方法與原理

本法適用于口蹄疫病毒油佐劑滅活疫苗總蛋白含量檢測,。本法系福林酚法(lowry法),，依據蛋白質分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cμ2+螯合形成蛋白質－銅復合物，此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原,，產生藍色化合物,，同時在堿性條件下酚試劑易被蛋白質中酪氨酸、色氨酸,、半胱氨酸還原呈藍色反應,。在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比，以蛋白質對照品溶液作標準曲線,，采用比色法測定供試品中蛋白質的含量,。

2.試劑與儀器

2.1試劑丙酮（分析純）、無菌去離子水,、商品化Lowry法改良試劑盒,；

2.2設備酶標儀（全波長），“Μ”型96孔板,，卡介苗注射器,，單通道和多通道移液器，渦旋震蕩儀,，酶標板振蕩器等,。

3.操作步驟

3.1標準系列稀釋液制備將商品化試劑盒內標準牛血清白蛋白（2mg/ml母液），按下表依次稀釋,。

編號	1	2	3	4	5	6	7	8	9
母液（μl）	0	5	25	50	100	150	200	300	400
去離子水（μl）	400	395	375	350	300	250	200	100	0
終濃度（μg/ml）	0	25	125	250	500	750	1000	1500	2000

3.2檢驗疫苗處理取1瓶疫苗恢復至室溫搖勻后,，在3個1.5 ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮,，充分混勻，室溫放置10分鐘,，在4℃條件下,，以15000 g離心15分鐘。吸棄液相,，沉淀物用400μl丙酮洗滌2次,，室溫干燥約15分鐘，加50μl去離子水復溶備用,。

3.3反應板加樣與讀數

3.3.1各取3.1稀釋的各濃度牛血清白蛋白標準溶液40μl,，以及三重復待檢疫苗樣品40μl，分別加入到96孔板內,。用排槍迅速加入200μl改良lowry法試劑盒內試劑,，立即用振蕩器混勻30秒；

3.3.2封膜,，室溫孵育10分鐘,；

3.3.3各孔內分別加入20μl 1倍酚試劑（試劑盒內為2倍，用前用去離子水現(xiàn)稀釋）,，立即用振蕩器混勻30秒,；

3.3.4封膜，室溫孵育30分鐘,；

3.3.5酶標儀測定750nm吸光值,，保存讀數。

3.4數據處理

根據系列標準蛋白稀釋液的濃度（0μg/ml～2000μg/ml）和750nm吸光值,，使用EXCEL以吸光值為X軸,，以蛋白標準濃度為Y軸，繪制標準曲線,，依據趨勢線求得多項式,，其多項式R2≥0.98。

將被檢樣品的吸光值代入標準蛋白獲得的多項式,，計算樣品中蛋白含量,，根據取樣量求得1ml樣品中蛋白含量。例如口蹄疫滅活疫苗水相/油相比例為1:1,，免疫劑量為2ml時,，100μl疫苗經丙酮沉淀后用50μl去離子水復溶，測得濃度即為每頭份疫苗中蛋白濃度,，或2ml疫苗中蛋白濃度,。結果判定時，將測定值除以2即得每毫升疫苗中總蛋白含量,。

3.5結果判定

若測定結果為每毫升疫苗總蛋白含量小于或等于500μg，則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規(guī)定；若測定結果為每毫升疫苗總蛋白含量大于500μg,，判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規(guī)定,。

3.6檢測數據處理舉例

3.6.1收集數據如表所示

Value	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	0.102	0.149	0.336	0.504	0.836	1.122	1.334	1.702	1.923	--	--	--
B	0.677	1.722	0.252	1.116	2.167	1.020	--	--	--	--	--	--
C	0.640	1.704	0.230	1.050	2.195	0.962	--	--	--	--	--	--
D	0.641	1.716	0.225	1.061	2.175	1.012	--	--	--	--	--	--
E	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--
F	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--
G	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--
H	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--	--

上述表格中，A1-A9為系列稀釋的標準牛血清白蛋白溶液,，A1至A9蛋白濃度依次增高,；B、C,、D行中1-6列為檢測樣品750nm吸光值,，B1-B6為6批不同批次疫苗樣品，每一列為同一疫苗樣品三個重復,。

3.6.2繪制標準曲線：將上表中數據復制到EXCELL表格中,，

Value	1	2	3	4	5	6	7	8	9
OD750	0.102	0.149	0.336	0.504	0.836	1.122	1.334	1.702	1.923
蛋白濃度μg/ml	0	25	125	250	500	750	1000	1500	2000

采用EXCEL程序，選中1-9列對應的兩行數據→“插入”→“散點圖”,，選擇“帶平滑線和數據標記的散點圖”,，得到以750nm吸光值為X軸，以蛋白濃度為Y軸的曲線圖,。選擇“圖表工具”中“布局”→ “趨勢線”→“其他趨勢線選項”,，選中“多項式”、“顯示公式”和“顯示R平方值”,。通常R平方值大于等于0.98表明標準曲線可信,。每一塊96孔板應設一組標準并繪制相應標準曲線。

3.6.3數值計算

以樣品測定OD750值為X,，代入y = 411.69x2+ 220.65x - 3.9423,，Y為蛋白濃度，以表中第一批疫苗測定結果為例,。該疫苗三重復測定的OD750數據（X）分別為：0.677,、0.640、0.641,，代入公式計算蛋白含量（Y）分別為：334μg/ml,、306μg/ml、307μg/ml,，該數據為每毫升水相抗原中總蛋白含量,。計算三重復數值的平均值（AVERAGE）為316μg/ml，標準差（STDEV.P）為13.1,，變異系數為4.15%（標準差/平均值*100%）,，將每毫升水相抗原中總蛋白含量，除以2折算為每毫升疫苗總蛋白含量,，該疫苗的總蛋白含量為138μg/ml,。按照上述方法,，可計算其他樣品的總蛋白含量。

3.6.4結果判定

同一樣品不同重復間變異系數應小于5.3%,，否則試驗不成立,，應重做。若測定值小于或等于500μg/ml,，則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規(guī)定,；若測定值大于500μg/ml，則判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規(guī)定,。

中華人民共和國農業(yè)部公告第2078號

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